布魯氏菌病實驗室診斷方法研究進(jìn)展

 布魯氏菌病 (Brucellosis)簡稱布病，也稱馬耳他熱，是由布魯氏菌屬(Brucella)細(xì)菌引起的一種人畜共患傳染病。臨床上主要引起人的波狀熱和慢性感染，引起懷孕母畜流產(chǎn)、死胎，公畜發(fā)生睪丸炎等，給人的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重危害。近年來，我國布魯氏菌病在人間和畜間的流行傳播呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅著人們的健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)。及時準(zhǔn)確地診斷布魯氏菌病對該病的防治和凈化具有重要的現(xiàn)實意義，本文主要是結(jié)合布魯氏菌病的危害，對布魯氏菌病的實驗室診斷方法研究進(jìn)展進(jìn)行概述，以供參考。

      布魯氏菌病 (Brucellosis)是由布魯氏桿菌引起人和動物共患的慢性傳染病。布魯氏桿菌是一種革蘭氏陰性、胞內(nèi)寄生菌。1886年，英國軍醫(yī)Bruce從一名因“馬耳他熱”死亡的士兵脾臟中分離確認(rèn)。根據(jù)布魯氏菌的病原性和生化特性將該布病分為6個種20個生物型，包括3個羊布魯氏菌(Br.melitensis)、9個牛種布魯氏菌(Br.abortus)、5個豬布魯氏菌(Br.suis)、1個綿羊附睪種布魯氏菌(Br.ovis)、1個沙林鼠布魯氏菌(Br.neotomae)、1個犬布魯氏菌(Br.canis)。目前，還發(fā)現(xiàn)了生物學(xué)特性有別于前面6種布魯氏菌的海洋鯨型海洋種(Br.ceti)和鰭型海洋種(Br.pinnipedialis)。

1 布魯氏菌病的危害

      布魯氏菌病可以感染多種動物和人，包括家畜、人和野生動物。發(fā)病及帶菌動物是主要的傳染源?；疾游锏姆置谖铩⑴判刮?、流產(chǎn)胎兒及乳汁等含有大量病菌，患病公畜精液中也含有病菌。在已知的6種布魯氏菌中，牛種、羊種、豬種布魯氏菌對人有較強(qiáng)的致病力和侵襲性，但以羊種布病感染最為嚴(yán)重。臨床上母畜感染后主要表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎或者弱胎，母畜流產(chǎn)后會發(fā)生子宮炎或者膿腫導(dǎo)致生育能力下降。公畜感染后多表現(xiàn)為睪丸炎和附睪炎，導(dǎo)致配種能力下降。

      人感染布魯氏菌病主要是因為過多的接觸患布病動物(如豬、牛、羊等)及其動物產(chǎn)品引起的。急性感染后常表現(xiàn)為發(fā)熱、多汗、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及肝脾腫大，慢性感染則多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛。目前，該病在世界各地均有不同程度的流行，給發(fā)生國家和地區(qū)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2 布魯氏菌病診斷技術(shù)

2.1 病原學(xué)診斷

       病原學(xué)檢測是診斷布魯氏菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”。主要包括病料的采集、保存、分離培養(yǎng)和鑒定等。試驗通常在無菌條件下取流產(chǎn)胎兒、胎盤、陰道分泌物或者乳汁，直接鏡檢或者接種于肝湯瓊脂培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基，根據(jù)菌落的形態(tài)特征、生化反應(yīng)及染色特點進(jìn)行判斷。布魯氏菌多用科茲洛夫斯基染色法染色，顯微鏡下為紅色球狀小桿菌，散在分布，偶見成對、短鏈或串狀排列。但由于病原的分離率低，加上培養(yǎng)時間長，常常影響該病的及時診斷，加上該病對實驗室人員和環(huán)境要求較高，該方法不適合用于臨床快速診斷。

2.2 免疫學(xué)診斷

      血清學(xué)診斷方法是免疫學(xué)診斷方法中最常用的檢測方法。包括虎紅平板凝集試驗(RBPT)、試管凝集試驗(SAT)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)、膠體金標(biāo)試驗(GICA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。還有專門用于檢測乳用動物布病的全乳環(huán)狀凝集試驗(MRT)。

2.2.1 虎紅平板凝集試驗(RBPT)

      虎紅平板凝集試驗是國際貿(mào)易中牛、羊、豬布魯氏菌病檢測的指定試驗，在我國也用于人布魯氏菌病監(jiān)測的初篩?？乖墙?jīng)培養(yǎng)滅活后，離心收集菌體用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成。該方法靈敏度高，操作方便，檢測快速且價格便宜，適于動物群體布魯氏菌病的普查。

2.2.2 試管凝集試驗(SAT)

      SAT是布病的確診試驗之一，與RBPT相比，該方法準(zhǔn)確性高，可以定量測定抗體水平，具有較高的特異性，能夠識別IgM抗體，可以用于布病的早期診斷。需要注意的是，RBPT和SAT都屬于凝集試驗，SAT通過識別布魯氏菌LPS-O鏈抗原進(jìn)行反應(yīng)，而LPS-O鏈抗原是多種革蘭氏陰性菌的共同抗原，因此SAT無法鑒別布魯氏菌與其他革蘭氏陰性菌存在的交叉感染。另外，該方法操作繁瑣，反應(yīng)時間長，不適用于現(xiàn)場疫情快速診斷。

2.2.3 補(bǔ)體結(jié)合試驗(CFT)

      補(bǔ)體結(jié)合試驗主要通過觀察綿羊紅細(xì)胞是否發(fā)生溶血來判斷受檢血清中有無待檢抗體。該方法靈敏性高，特異性強(qiáng)，對于牛、羊、綿羊附睪種布病的臨床診斷具有較高的應(yīng)用價值。特別是對于RBPT初篩陽性或者SAT診斷可疑的均可用CFT進(jìn)行確診。但是由于豬補(bǔ)體能夠干擾豚鼠補(bǔ)體，導(dǎo)致實驗敏感性下降38%左右，因此不適用于豬布病診斷。

2.2.4 膠體金標(biāo)試驗(GICA)

      GICA是用膠體金作為示蹤標(biāo)記物，用于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。朱明東等人的研究證明，GICA操作簡單，血清用量少，反應(yīng)快速，可以用于布病的初篩、現(xiàn)場疫情快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查等。朱明東對GICA在布病不同流行地區(qū)的現(xiàn)場應(yīng)用效果的比較，證明GICA不僅可以及時快速發(fā)現(xiàn)患者，而且可以監(jiān)測疫情，反映流行程度，具有較好的推廣應(yīng)用前景。程婷婷建立的GICA方法，鑒別診斷了布魯氏菌自然感染和人工免疫，區(qū)分了牛、羊種布魯氏菌感染，可在基層推廣使用。但是該方法只能定性診斷，不能實現(xiàn)定量測定，其質(zhì)控指標(biāo)和靈敏度也需進(jìn)一步提高。

2.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

      ELISA是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種靈敏性高、特異性強(qiáng)的高效的抗體檢測新技術(shù)。該方法操作方便，既可以作為確定診斷，又可以作為篩選和鑒別診斷。在布病檢測中，只有牛布病ELISA是國際貿(mào)易指定的，并主要用于血清和乳樣中的抗體檢測。

      目前用于布病檢測的ELISA有間接ELISA(iELISA)和競爭ELISA(cELISA)兩種。ELISA首次用于布病檢測，敏感性比SAT高出1~100倍。目前布病ELISA試劑盒選用的抗原主要是LPS-S，而該抗原在LPS的O鏈上，但粗糙型布魯氏菌缺乏O鏈，所以基于LPS-S抗原的檢測方法無法檢測到粗糙型布魯氏菌產(chǎn)生的抗體。

       同時，雖然ELISA靈敏度高，特異性強(qiáng)，但并不能區(qū)分免疫接種產(chǎn)生的抗體還是自然感染產(chǎn)生的抗體。同時，還存在不能有效排除耶爾森氏菌O9和大腸桿菌O157感染動物的血清干擾，從而使ELISA方法的特異性受到一定程度影響。但仍然被OIE列為診斷牛布病的推薦方法。

2.2.6 全乳環(huán)狀凝集試驗(MRT)

      全乳環(huán)狀試驗方法主要用于泌乳奶畜的布病初篩。MRT本質(zhì)是抗原抗體反應(yīng)，當(dāng)乳汁中存在布病抗體時，紅色的抗原抗體復(fù)合物就會轉(zhuǎn)移至乳脂層，從而形成紫紅色的乳脂環(huán)。該方法操作簡便，反應(yīng)時間短，避免了因采血難而帶來的諸多弊端，可用于大規(guī)模奶牛篩查檢測，大大提高了奶牛布病監(jiān)測工作進(jìn)度。但該方法不適用于檢測患乳房炎及其他乳房疾病母牛的乳、初乳、脫脂乳和煮沸過的乳以及腐敗、變酸和凍結(jié)的乳。

2.3 分子生物學(xué)診斷

   分子生物學(xué)診斷技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)、實時熒光定量PCR(RT-PCR)、核酸探針檢測、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)。

2.3.1 PCR檢測

      PCR技術(shù)作為一種快速、準(zhǔn)確、靈敏、高效的基因診斷技術(shù)已成為當(dāng)前布魯氏菌病分子生物學(xué)檢測和病原學(xué)分型的重要手段。目前，普通PCR主要是通過檢測編碼布魯氏菌BCSP-31和Omp外膜蛋白基因的原理。但是單對的引物不能區(qū)分鑒別布魯氏菌生物型。

      1990年，PCR在布病的應(yīng)用首次報道，從此應(yīng)用分子生物學(xué)診斷布病迅速發(fā)展。1994年，Bricker建立了AMOS-PCR檢測方法，是最早建立的布病多重PCR，實現(xiàn)了一個反應(yīng)體系同時檢出多種布魯氏菌生物型，具有很好的使用價值。后經(jīng)過改進(jìn)，該方法鑒別菌種的類型進(jìn)一步完善。鐘旗等人用該方法進(jìn)行布病研究，發(fā)現(xiàn)AMOS-PCR的特異性、靈敏性均高于細(xì)菌分離和血清學(xué)診斷方法。葉勇剛建立的奶牛布病PCR方法，可有效檢出奶牛布魯氏菌，且最低可檢出1CFU的DNA.豆玲建立的布魯氏菌與炭疽菌的多重PCR方法，最低可檢出345fg/uL的含量DNA。

2.3.2 RT-PCR檢測

      熒光定量PCR是在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，最大的優(yōu)點就是通過捕捉實時熒光信號對擴(kuò)增的布病核酸進(jìn)行標(biāo)量，直觀的將結(jié)果呈現(xiàn)在電腦上。

      2000年，Redkar用熒光標(biāo)記引物探針，建立了可以特異性檢測牛、羊、豬布魯氏菌的RT-PCR方法。劉志國等人建立的基于Taqman探針的多重?zé)晒釶CR實現(xiàn)了在快速檢測布病的同時還能鑒別診斷是牛種還是羊種布病。

      目前，RT-PCR是最靈敏、最準(zhǔn)確的檢測樣品中核酸含量的方法，該方法克服了PCR在平臺期的誤差，實現(xiàn)了核酸的準(zhǔn)確定量，避免了電泳造成的污染和誤差。但是該方法需要有特殊的設(shè)備，且成本較高，因此不適于在基層推廣和現(xiàn)場檢測。

2.3.3 核酸探針檢測

      核酸探針技術(shù)是利用核苷酸嚴(yán)格配對原理發(fā)展起來的核酸探針雜交技術(shù)，是目前分子生

      物學(xué)中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)之一。該方法靈敏度高，特異性好，操作簡便，可以一次性檢測大批量樣本，適合用于臨床樣本檢測和流行病學(xué)調(diào)查。由于核酸探針可以多次重復(fù)利用，大大降低了檢測成本。

      王希良等人制備的布魯氏菌核酸探針檢測布病，顯示出很好的特異性和靈敏性，利用地高辛標(biāo)記探針，建立的Dot-blot最低可檢出5pg的核酸。Mater制備的地高辛標(biāo)記探針，完全可以用于血清學(xué)陽性和慢性病人血清的布魯氏菌病的檢測，并且具有較強(qiáng)的特異性。2000年，F(xiàn)ernández用牛布魯氏菌16S rRNA序列制備的3種核酸探針能夠鑒別診斷了部分豬種布魯氏菌與其他布魯氏菌，顯示出重要的應(yīng)用價值。

2.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)

      與PCR檢測技術(shù)類似，LAMP也是通過特異性的擴(kuò)增布魯氏菌核苷酸序列對檢測病原做出判斷。

      潘文等人建立了針對布魯氏菌omp25基因的可視化LAMP檢測方法，對S19株、S2、M5三株布魯氏菌疫苗檢測，結(jié)果顯示出很好的擴(kuò)增效果。許鄒亮等人建立的LAMP檢測方法，最低可檢出17fg的DNA，顯示出良好的靈敏性。劉玉梅用建立的LAMP和RT-PCR對10份布魯氏菌病陽性血清的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP與RT-PCR有同樣的靈敏度和特異性，且LAMP方法更快速、簡便，經(jīng)濟(jì)，無需專用儀器設(shè)備，更適用于基層醫(yī)院對布魯氏菌的快速檢測。趙志兵建立的LAMP法，具有高度的特異性和靈敏性，對17種常見菌株的擴(kuò)增結(jié)果為陰性，對S2、M5、104 M、55226四種布魯氏菌疫苗株靈敏度分別達(dá)到5×10^-4ng/μL、5×10^-5ng/μL、5×10-3ng/μL和5×10-4ng/μL，并且在30 min以內(nèi)完成檢測。該方法快速、靈敏、特異，有望成為快速檢測布魯氏菌的有效手段。

       隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，新型的可視化LAMP方法表現(xiàn)出越來越多的優(yōu)勢，不僅對設(shè)備要求不高，而且容易操作，特別是肉眼可見的陽性結(jié)果，一步判定結(jié)果，降低了布病檢測的危險性，適合在基層推廣應(yīng)用。

3 總結(jié)

       綜上所述，國內(nèi)外布魯氏菌病的實驗室診斷方法較多，主要還是免疫學(xué)的RMBP、SAT、CFT、GICA、ELISA和MRT，以及分子生物學(xué)的PCR、核酸探針檢測和LAMP，這些方法各有優(yōu)點和不足，可以根據(jù)工作需要選擇幾種方法結(jié)合使用。目前，隨著ELISA和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，其靈敏性高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)勢越來越凸顯，逐漸成為布魯氏菌病檢測的重要手段。但開發(fā)特異、靈敏、能鑒別診斷自然感染與疫苗免疫的檢測法仍然是目前亟待解決的問題。

來源：中國畜牧獸醫(yī)報