動(dòng)物源金黃色葡萄球菌的分離與鑒定方法

范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用于耐藥性測(cè)定的動(dòng)物源金黃色葡萄球菌的分離和鑒定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛奶、動(dòng)物組織和上呼吸道中金黃色葡萄球菌的分離和鑒定。

設(shè)備和材料

   除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

1.冰箱：0℃～4℃和-20℃。

2.恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃和42℃。

3.顯微鏡：10×～100×。

4.商品化或自制采樣管。

5.無菌離心管

6.離心機(jī)。

8.商品化拭條或微生物鑒定儀。

培養(yǎng)基和試劑

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌ATCC29213

2.顯色培養(yǎng)基

3.7.5%氯化鈉肉湯10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯

4.營養(yǎng)肉湯或BHI肉湯

5.營養(yǎng)瓊脂

6.新鮮兔血漿或商品用凝固酶試驗(yàn)兔血漿

7.0.3%過氧化氫液

8.0.85%無菌生理鹽水

金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序

金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序見圖。

圖  金黃色葡萄球菌分離和鑒定程序

操作步驟

1.采樣

1.1牛奶樣品：到已選定的奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，現(xiàn)場(chǎng)采牛奶置入滅菌試管中，0℃～4℃保存，不超過48h。

1.2扁桃體、發(fā)病動(dòng)物組織和上呼吸道拭子：無菌操作取發(fā)病動(dòng)物組織和上呼吸道拭子，上呼吸道拭子置入滅菌試管中，0℃～4℃保存不超過48h。

1.3吸取1mL牛奶樣品或?qū)⑸虾粑朗米又潦⒂?0mL 7.5%氯化鈉肉湯或10 %氯化鈉胰酪胨大豆肉湯中，振蕩混勻。

2.增菌和分離培養(yǎng)

2.1將上述樣品勻液于36℃±1℃培養(yǎng)18～24 h。金黃色葡萄球菌在7.5%氯化鈉肉湯中呈混濁生長。

2.2將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到顯色培養(yǎng)基平板上，無菌操作將發(fā)病動(dòng)物組織直接劃線， 36℃±1℃培養(yǎng)24～48h。

2.3挑取可疑菌落。用營養(yǎng)瓊脂純化一代，待進(jìn)一步細(xì)菌鑒定。

3.金黃色葡萄球菌的鑒定

3.1生化鑒定 將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24小時(shí)以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，應(yīng)為陽性。

將新鮮純化、經(jīng)觸酶試驗(yàn)陽性待檢細(xì)菌單個(gè)菌落，懸浮于5mL滅菌生理鹽水，按照生化鑒定試條使用說明書操作，37℃培養(yǎng)18～24h后判讀結(jié)果。

3.2血漿凝固酶試驗(yàn)法 挑取顯色平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mL BHI和營養(yǎng)瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18～24h。將在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)24h以內(nèi)的待鑒定細(xì)菌，首先進(jìn)行觸酶試驗(yàn)，應(yīng)為陽性。

  新鮮兔血漿制備：稱取檸檬酸鈉3.8g，加蒸餾水100mL,溶解后過濾，裝瓶，121℃高壓滅菌15min。取3.8%檸檬酸鈉溶液一份，加兔全血四份，混好靜置 (或以3000r/min 離心30 min)，使血液細(xì)胞下降，即可得血漿。

取新鮮配置兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入BHI 培養(yǎng)物0.2～0.3 mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。

同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對(duì)照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。